28 / 30
736
Capitolo 18
TECNICHE DI BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE
di fase
aggira questa difficoltà, rendendo più visibili oggetti
altamente trasparenti (Figura 18.6
b
). La possibilità di vede-
re le diverse parti di uno stesso oggetto dipende dalla loro
capacità di interagire con la luce in maniera diversa l’una
dall’altra. Alla base di queste differenze troviamo l’indice di
rifrazione. Gli organelli cellulari sono composti da diverse
proporzioni di varie molecole: DNA, RNA, proteine, lipidi,
carboidrati, sali e acqua. Regioni a composizione diversa do-
vrebbero avere differente indice di rifrazione. Normalmente,
però, tali differenze non possono essere percepite dai nostri
occhi. Il microscopio a contrasto di fase converte le diffe-
renze di indice di rifrazione in differenze di intensità (lumi-
nosità e oscurità relative), che sono quindi visibili all’occhio.
Il microscopio a contrasto di fase raggiunge questo risultato
(1) separando la luce diretta dalla luce diffratta dall’oggetto
e (2) facendo sì che i raggi di luce da queste due sorgenti
interfersiscano
tra di loro. La luminosità o oscurità relativa
di ogni parte dell’immagine riflette il modo in cui la luce
proveniente da quella parte del campione interferisce con la
luce diretta.
I microscopi a contrasto di fase sono particolarmente utili
nell’esame di componenti intracellulari di cellule vive ad una
risoluzione relativamente alta. Per esempio, la mobilità di-
namica dei mitocondri, dei cromosomi mitotici e dei vacuoli
può essere osservata e filmata con questa ottica. Il semplice
fatto di osservare il modo in cui piccole particelle e vacuoli
nelle cellule sono spinti in giro in maniera casuale produce
una eccitante immagine dello stato vitale, non ottenibile con
l’osservazione di cellule morte colorate. Il maggiore vantag-
gio derivato dall’invenzione del microscopio a contrasto di
fase non è stata la scoperta di nuove strutture, ma il suo uso
quotidiano, nella ricerca e nei laboratori didattici, per l’os-
servazione di cellule in un modo più dimostrativo.
Il microscopio a contrasto di fase presenta difetti ottici
che portano alla perdita di risoluzione e a vari tipi di aloni di
interferenza e ombre ai margini dove avvengono netti cam-
biamenti nell’indice di rifrazione. Il microscopio a contrasto
di fase è un tipo di
microscopio a interferenza
. Sono stati co-
struiti altri tipi di microscopi interferenziali che minimizza-
no questi artefatti ottici, ottenendo una completa separazio-
ne dei raggi diretti e diffratti con l’uso di complessi percorsi
di luce e prismi. Un altro tipo di ottica ad interferenza, detta
contrasto interferenziale differenziale (DIC)
, o a volte inter-
ferenza Nomarski, dal nome del suo progettista, dà un’im-
magine che ha un’apparente qualità tridimensionale (Figu-
ra 18.6
c
). Il contrasto nella microscopia DIC dipende dal
grado di cambiamento dell’indice di rifrazione attraverso il
campione. Di conseguenza, i margini delle strutture, dove
l’indice di rifrazione varia in modo marcato su una breve di-
stanza, si vedono con un contrasto particolarmente efficace.
La microscopia a fluorescenza
(e tecniche correlate basate sulla fluorescenza)
Nel corso dell’ultimo ventennio il microscopio ottico si è
trasformato da uno strumento atto principalmente ad esa-
minare sezioni di tessuto fissato ad uno strumento che per-
mette l’osservazione di eventi dinamici che si verificano a
livello molecolare nelle cellule viventi. Questi avanzamenti
si sono realizzati grazie agli sviluppi nel campo della
mi-
croscopia a fluorescenza
. Il microscopio a fluorescenza per-
mette di osservare la localizzazione di certe molecole (dette
fluorocromi
o
fluorofori
). I fluorofori assorbono radiazioni di
lunghezza d’onda ultravioletta, invisibile, e rilasciano parte
dell’energia in forma di luce visibile con lunghezza d’onda
maggiore, un fenomeno chiamato
fluorescenza
. Una sorgente
di luce del microscopio produce un fascio di luce ultravio-
letta che passa attraverso un particolare sistema di filtri che
impediscono il passaggio a tutte le lunghezze d’onda tranne
quelle che eccitano un fluorocromo specifico. Il raggio di
luce monocromatica viene quindi focalizzato sul campione
contenente il fluorocromo, che diventa eccitato ed emette
luce visibile che viene raccolta dalle lenti dell’obiettivo e la
focalizzano in un’immagine che si può osservare. Poiché la
luce della sorgente del microscopio a fluorescenza è ultra-
violetta, ossia nera, oggetti colorati con fluorocromi brillano
su uno sfondo scuro e l’intera immagine si presenta di in-
tenso contrasto.
Figura 18.6
Confronto tra cellule viste con differenti tipi di micro-
scopi ottici.
Foto al microscopio ottico di un protista ciliato osservato
in campo chiaro (
a
), contrasto di fase (
b
) e contrasto interferenziale
differenziale (DIC) (o Nomarski) (
c
). Il microrganismo è praticamente
invisibile con l’illuminazione in campo chiaro, ma chiaramente visibi-
le in contrasto di fase e con microscopia DIC.
(M
ICROGRAFIA
DI
M. I.
W
ALKER
/P
HOTO
R
ESEARCHERS
, I
NC
.)
(a)
(b)
(c)