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Tecniche di biologia cellulare e molecolare
18.1
Microscopio ottico
18.2
Microscopio elettronico a trasmissione
18.3
Microscopio elettronico a scansione e
microscopio a forza atomica
18.4
Uso di radioisotopi
18.5
Colture cellulari
18.6
Frazionamento dei componenti cellulari
per centrifugazione differenziale
18.7
Isolamento, purificazione e
frazionamento delle proteine
18.8
Determinazione della struttura di proteine
e complessi a più subunità
18.9
Frazionamento di acidi nucleici
18.10
Ibridazione degli acidi nucleici
18.11
Sintesi chimica del DNA
18.12
Tecnologia del DNA ricombinante
18.13
Amplificazione enzimatica del DNA
con la PCR
18.14
Sequenziamento del DNA
18.15
Librerie di DNA
18.16
Trasferimento di DNA in cellule eucariotiche
ed in embrioni di mammifero
18.17
Determinazione della funzione di geni
eucariotici mediante eliminazione genica
o silenziamento
18.18
Uso degli anticorpi
Impiego di una duplice fluorescenza per seguire eventi dinamici
all’interno di organelli cellulari in cellule vive. Le cisterne di Golgi
di una cellula di lievito gemmante non sono disposte in pile distinte
come nella maggior parte delle cellule eucariotiche ma sono disperse
nel citoplasma. Ciascuna delle strutture ovali brillantemente colo-
rate è una singola cisterna il cui colore dipende dalla localizzazione
delle molecole proteiche marcate con fluorocromi. Una cisterna che
appare verde contiene una proteina GFP-marcata (Vrg4) coin-
volta in attività precoci del Golgi, mentre una cisterna che appare
rossa contiene una proteina DsRed-marcata (Sec7) coinvolta in
attività tardive del Golgi. Questa serie di micrografie rivela la
composizione proteica di singole cisterne in un periodo di circa 13
minuti (il momento in cui è presa l’immagine è indicato in basso
a sinistra). La testa di freccia bianca e la freccia individuano due
di queste cisterne nel tempo. Le due cisterne sono mostrate tal quali
nelle micrografie in basso. Dalle micrografie si può osservare che la
composizione proteica di una cisterna varia nel tempo da una con-
tenente proteine “precoci” (verdi) ad una contenente proteine “tar-
A
causa delle dimensioni molto ridotte dell’oggetto di studio, la
biologia cellulare e la biologia molecolare sono più dipendenti
dallo sviluppo di nuovi strumenti e tecnologie che ogni altra bran-
ca della biologia. Di conseguenza, è difficile studiarle senza ap-
prendere anche la tecnologia necessaria per raccogliere i dati. In
questo capitolo esamineremo i metodi usati più comunemente in
questo campo tralasciando alcuni dettagli e variazioni. Gli obiettivi