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Il candidato illustri lametodica del clonaggio geni-
co in cellule batteriche
Punti chiave
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Enzimi di restrizione
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Plasmidi
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DNA ligasi
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Trasformazione
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Marcatori di selezione
Svolgimento
Il clonaggio genico in cellule batteriche (in genere del batterio Gram-negativo
Escherichia coli
) prevede innanzitutto che il DNA contenente il gene di interes-
se venga idrolizzato tramite enzimi di restrizione. Questi enzimi tagliano il
DNA in siti specifici in base alla sequenza nucleotidica, producendo migliaia
di frammenti di diversa lunghezza, di cui uno conterrà il gene di interesse. Il
frammento in questione può essere separato dagli altri e purificato tramite
elettroforesi o cromatografia. La scelta degli enzimi di restrizione da usare per
il clonaggio di un determinato gene deve essere effettuata in base alla mappa
di restrizione del gene. Gli stessi enzimi di restrizione scelti per frammentare
il DNA genomico vengono utilizzati per digerire un vettore plasmidico, che è
la molecola di DNA in cui il gene verrà inserito. La reazione di idrolisi cata-
lizzata dagli enzimi di restrizione produce delle estremità appiccicose sia nel
frammento di DNA contenente il gene sia nel plasmide, che possono appaiarsi
per complementarità. A questo punto viene usato l’enzima DNA ligasi, che ca-
talizza la formazione di legami covalenti tra il frammento di DNA contenente
il gene di interesse e il plasmide. Il risultato di questa reazione è una molecola
di DNA ricombinante. Affinché le cellule possano incorporare il plasmide ri-
combinante, esse devono essere trattate in modo tale che la parete cellulare si
alteri e lasci passare il DNA esogeno (quando questo avviene, le cellule sono
chiamate competenti). Nel caso le cellule in questione siano batteriche, questo
processo è conosciuto con il nome di trasformazione, mentre si parla di trasfe-
zione nel caso di cellule eucariotiche. Nel caso di
E. coli
, le cellule possono es-
sere rese competenti attraverso esposizione a cloruro di calcio e shock termico.